无论是在免疫学、肿瘤学还是再生医学领域，只要是使用细胞的地方，细胞分离都起着决定性的作用。血液和组织样本中含有大量不同类型的细胞，它们共同组成了一个复杂的生物系统。然而，出于研究目的，通常需要有针对性地分离特定细胞或细胞群 。这是精确分析细胞特性、功能和相互作用的唯一方法。
然而，并非每种方法都同样适用。正确技术的选择取决于当前的问题，也取决于所需的纯度、活力和产量。这不仅是一个技术诀窍的问题，也是一个正确的工具和试剂的问题，只有这样才能实现标准化和可重复的分离。
细胞分离基础知识
细胞分离是从血液（全血）、骨髓或组织等异质混合物中分离出特定细胞或细胞群。其目的是获得所需的细胞，使其尽可能保持原样和功能。
对此有不同的方法：
- 物理特性：大小、密度或电荷
- 生物特征：表面标记、受体或抗原
- 机械分离：通过特殊筛网或薄膜进行过滤
挑战在于如何在纯度、速度和细胞保护之间找到平衡。有些方法的纯度很高，但也会对细胞造成较大压力。其他方法特别温和，但分离的特异性较低。
细胞群体的纯度
在细胞生物学中，描述了在一个分离过程中，所需细胞群体与其他不需要的细胞类型的比例。因此，纯度表示所分离的细胞分馏在其细胞组成方面有多“干净”。
- 分析准确性：高纯度是至关重要的，以确保测量结果（例如基因表达分析、蛋白质组学）确实可以归因于目标细胞群体。
- 可重复性：不纯的样品可能导致可变或矛盾的结果。
- 功能实验：污染细胞类型可能会影响靶细胞的生理反应或信号通路。
- 流式细胞术（Flow Cytometry）：最常用的方法；细胞根据特定的表面标记物进行特征化。
- 显微镜评估：形态学评估，通常是补充的。
- 分子分析：检测细胞特异性基因或蛋白质以验证均匀性。
孤立细胞的生存能力
指的是在细胞群体中，经过分离后完整、代谢活跃且存活的细胞所占的比例。细胞活力表示有多少分离的细胞仍然存活并且功能正常，与在分离过程中受到损伤或死亡的细胞相对。因此，细胞活力定义了分离后存活细胞的百分比，是评估分离细胞群体质量和适合性以进行进一步分析或培养的关键指标。
- 机械应力（例如，过度的移液或离心）
- 化学影响（例如，不适当的缓冲液、温度偏差）
- 过长或过于激进的处理过程
- 隔离前或隔离后的不利储存条件
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生存能力可以通过不同的方法来测量，例如：
- 台盼蓝排除法：死细胞吸收染料，活细胞则不吸收。
- 荧光染料如碘化丙啶（PI）、7-AAD或Annexin V/PI与流式细胞术结合使用。
- 自动化细胞计数器（例如 Countess，NucleoCounter）。
细胞分离的产量
在细胞生物学中，指的是在一个分离过程中成功获得的目标细胞的总数与原始样本中存在的细胞总数的比例。因此，产量表示实际能够分离出多少所需细胞，相对于理论上可能的最大值，并且是细胞分离中的一个关键效率参数。它提供了关于一个方法在多大程度上能够有效地、低损耗地获得所需细胞群体的信息。
产率以百分比计算，方法是将分离的靶细胞数量除以原始样本中靶细胞的数量，然后乘以100。如果在一个血样中估计含有1×10^6 CD4⁺-T细胞，分离后得到8×10^5 CD4⁺-T细胞，则产率为80%。
- 样本有限（例如，活检、稀有细胞类型），
- 需要大量细胞用于后续分析，
- 或者隔离过程需要被验证（例如，在临床研究或诊断中）。
- 分离方法的效率（例如，密度梯度离心、磁性分离、FACS）
- 由于粘附、过滤或移液造成的细胞损失
- 细胞聚集或团块形成
- 隔离前的储存时间和样本质量
细胞分离方法
细胞分离有多种方法。每种方法都有自己的优势、局限性和典型应用领域。
细胞筛或筛布用于根据大小或形状分离细胞。这种方法特别适用于从组织中制备单细胞悬浮液，或在后续分析前纯化样本。
优点：快速、简单、温和
缺点：与基于标记的方法相比，特异性较低
密度梯度离心是一项经典技术，主要用于从全血中分离外周血单核细胞（PBMC）。将血液分层置于具有特定密度的培养基（如PBMC Spin或 Ficoll）上，然后进行离心。细胞类型根据其密度聚集在不同的层上，这样就能很容易地提取出所需的部分。
优势：可靠、成本效益高
Nachteil: zeitaufwendig, weniger spezifisch als Marker gestützte Methoden
pluriBead 技术可从血液（全血）或组织等复杂样本中定向富集或去除特定类型的细胞。利用特异性抗体，将所需细胞与单分散小珠结合，然后利用过滤过程进行选择性分离--完全无需磁场。该工艺快速、温和、灵活：适用于不同类型的细胞，易于扩展，并能保留细胞的功能。是免疫细胞分析、单细胞研究制备或其他需要高纯度细胞群的应用的理想选择。
优势：特异性高、纯度好、速度快
缺点：试剂较贵，依赖标记物
磁激活细胞分拣（MACS）利用磁性颗粒与细胞表面标记物特异性结合。在磁场的帮助下，标记的细胞可以被特异性地富集或移除。这种技术在需要高纯度细胞群时特别有用，例如用于免疫细胞研究。这种方法既适用于阳性细胞分离，也适用于阴性细胞分离。
优势：特异性强，纯度高
缺点：试剂较贵，依赖标记物
荧光激活细胞分拣（FACS）是一种根据细胞表面标记和荧光信号对细胞进行单独分析和分拣的方法。这种技术不仅可以分离细胞，还能提供每个细胞的综合数据。
优点：特异性高、纯度好、耗时长
缺点：试剂和设备较为昂贵，对标记物有依赖性