Che si tratti di immunologia, oncologia o medicina rigenerativa, ovunque si utilizzino le cellule, la separazione cellulare svolge un ruolo decisivo. I campioni di sangue e di tessuto contengono un gran numero di tipi di cellule diverse, che insieme formano un sistema biologico complesso. A fini di ricerca, tuttavia, è spesso necessario isolare in modo mirato cellule o popolazioni cellulari specifiche . Solo così è possibile analizzare con precisione le loro proprietà, funzioni e interazioni.
Tuttavia, non tutti i metodi sono ugualmente adatti. La scelta della tecnica giusta dipende dal problema in questione e anche dalla purezza, dalla vitalità e dalla resa richieste. Non è solo una questione di know-how, ma anche di strumenti e reagenti adeguati che consentano una separazione standardizzata e riproducibile.
Fondamenti della separazione cellulare
La separazione cellulare è la separazione di cellule specifiche o gruppi di cellule da una miscela eterogenea, come quella che si verifica nel sangue (sangue intero), nel midollo osseo o nei tessuti. L'obiettivo è ottenere le cellule desiderate il più possibile inalterate e funzionali.
Esistono diversi approcci al riguardo:
- Proprietà fisiche: dimensioni, densità o carica elettrica.
- Caratteristiche biologiche: Marcatori di superficie, recettori o antigeni
- Separazione meccanica: filtrazione attraverso speciali setacci o membrane.
La sfida consiste nel trovare un equilibrio tra purezza, velocità e protezione delle cellule. Sebbene alcuni metodi offrano un elevato livello di purezza, possono anche sottoporre le cellule a una maggiore pressione. Altri metodi sono particolarmente delicati, ma separano in modo meno specifico.
Reinheit einer Zellpopulation
beschreibt in der Zellbiologie den Anteil der gewünschten Zellpopulation im Verhältnis zu anderen, unerwünschten Zelltypen nach einem Isolationsprozess. Die Reinheit gibt somit an, wie „sauber“ die isolierte Zellfraktion in Bezug auf ihre zelluläre Zusammensetzung ist.
- Analytische Genauigkeit: eine hohe Reinheit ist entscheidend, um sicherzustellen, dass Messergebnisse (z. B. Genexpressionsanalysen, Proteomik) tatsächlich auf die Zielzellpopulation zurückzuführen sind.
- Reproduzierbarkeit: unreine Proben können zu variablen oder widersprüchlichen Ergebnissen führen.
- Funktionelle Experimente: kontaminierende Zelltypen können die physiologischen Reaktionen oder Signalwege der Zielzellen beeinflussen.
- Durchflusszytometrie (Flow Cytometry): Häufigste Methode; Zellen werden anhand spezifischer Oberflächenmarker charakterisiert.
- Mikroskopische Auswertung: Morphologische Beurteilung, oft ergänzend.
- Molekulare Analysen: Nachweis zellspezifischer Gene oder Proteine zur Überprüfung der Homogenität.
Viabilität (Lebensfähigkeit) der isolierten Zellen
bezeichnet den Anteil intakter, stoffwechselaktiver und überlebensfähiger Zellen innerhalb einer Zellpopulation nach der Isolation. Die Viabilität gibt an, wie viele der isolierten Zellen noch leben und funktionsfähig sind, im Gegensatz zu Zellen, die durch den Isolationsprozess geschädigt oder abgestorben sind. Somit definiert die Viabilität den Prozentsatz lebender Zellen nach der Isolation und ist ein zentraler Indikator für die Qualität und Eignung der isolierten Zellpopulation für weiterführende Analysen oder Kulturen.
- Mechanischer Stress (z. B. zu starkes Pipettieren oder Zentrifugieren)
- Chemische Einflüsse (z. B. ungeeignete Puffer, Temperaturabweichungen)
- Zu lange oder aggressive Aufarbeitungsprozesse
- Ungünstige Lagerungsbedingungen vor oder nach der Isolation
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Die Viabilität kann mit verschiedenen Methoden gemessen werden, z. B.:
- Trypanblau-Ausschlussverfahren: Tote Zellen nehmen den Farbstoff auf, lebende nicht.
- Fluoreszenzfarbstoffe wie Propidiumiodid (PI), 7-AAD oder Annexin V/PI in Kombination mit Durchflusszytometrie.
- Automatisierte Zellzähler (z. B. Countess, NucleoCounter).
Ausbeute bei der Zellisolation
bezeichnet in der Zellbiologie die Gesamtzahl der erfolgreich gewonnenen Zielzellen nach einem Isolationsverfahren im Verhältnis zur ursprünglich vorhandenen Zellzahl in der Ausgangsprobe. Die Ausbeute gibt also an, wie viele der gewünschten Zellen tatsächlich isoliert werden konnten, bezogen auf das theoretisch mögliche Maximum und ist ein zentraler Effizienzparameter bei der Zellisolation. Sie gibt Auskunft darüber, wie effektiv ein Verfahren in der Lage ist, die gewünschte Zellpopulation verlustarm und zielgerichtet zu gewinnen.
Die Ausbeute in % errechnet sich indem die Anzahl isolierter Zielzellen durch die Anzahl der Zielzellen in der Ausgangsprobe dividiert wird und dann mit 100 multipliziert wird. Wenn in einer Blutprobe schätzungsweise 1×10^6 CD4⁺-T-Zellen enthalten sind und nach der Isolation 8×10^5 CD4⁺-T-Zellen vorliegen, beträgt die Ausbeute 80 %.
- die Ausgangsproben limitiert sind (z. B. Biopsien, seltene Zelltypen),
- große Zellmengen für nachfolgende Analysen benötigt werden,
- oder der Isolationsprozess validiert werden soll (z. B. in klinischen Studien oder Diagnostik).
- Effizienz der Trennmethode (z. B. Dichtegradientenzentrifugation, magnetische Separation, FACS)
- Zellverluste durch Adhäsion, Filtration oder Pipettieren
- Zellaggregation oder Klumpenbildung
- Lagerungszeit und Probenqualität vor der Isolation
Metodi di separazione cellulare
Per la separazione delle cellule sono disponibili diversi metodi. Ogni metodo ha i suoi punti di forza, i suoi limiti e le sue aree di applicazione tipiche.
I setacci cellulari o i teli di setaccio sono utilizzati per separare le cellule in base alle dimensioni o alla forma. Questo metodo è particolarmente pratico per la preparazione di sospensioni di singole cellule da tessuti o per la purificazione di campioni prima di successive analisi.
Vantaggio: rapido, facile, delicato
Svantaggio: minore specificità rispetto ai metodi basati su marcatori
La centrifugazione a gradiente di densità è una tecnica classica utilizzata principalmente per isolare le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) dal sangue intero. Il sangue viene stratificato su un terreno con una densità definita (ad esempio, PBMC Spin o Ficoll) e centrifugato. I tipi di cellule si accumulano in strati diversi a seconda della loro densità, in modo da poter estrarre facilmente la frazione desiderata.
Vantaggio: affidabile, conveniente
Nachteil: zeitaufwendig, weniger spezifisch als Marker gestützte Methoden
La tecnologia pluriBead consente l'arricchimento o la rimozione mirata di specifici tipi di cellule da campioni complessi come sangue (sangue intero) o tessuti. pluriBead è una combinazione di specificità biologica e separazione meccanica. Utilizzando anticorpi specifici, le cellule desiderate vengono legate a piccole microsfere monodisperse e quindi separate selettivamente mediante processi di filtrazione, completamente senza campo magnetico. Il processo è rapido, delicato e flessibile: è adatto a diversi tipi di cellule, può essere facilmente scalato e preserva la funzionalità delle cellule. Ideale per analisi di cellule immunitarie, preparazioni per studi su singole cellule o altre applicazioni in cui sono richieste popolazioni cellulari di elevata purezza.
Vantaggi: elevata specificità, buona purezza, rapidità
Svantaggi: reagenti più costosi, dipendenza dai marcatori
Il MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) utilizza particelle magnetiche che si legano specificamente ai marcatori della superficie cellulare. Le cellule marcate possono quindi essere arricchite o rimosse in modo specifico con l'aiuto di un campo magnetico. Questa tecnica è particolarmente utile quando sono necessarie popolazioni cellulari di elevata purezza, ad esempio per studi sulle cellule immunitarie. Questo metodo è adatto per la separazione cellulare sia positiva che negativa.
Vantaggi: elevata specificità, buona purezza
Svantaggi: reagenti più costosi, dipendenza dai marcatori
Il FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) è un metodo in cui le cellule possono essere analizzate e selezionate individualmente in base ai loro marcatori di superficie e ai segnali di fluorescenza. Questa tecnica non solo consente la separazione, ma fornisce anche dati completi su ogni singola cellula.
Vantaggio: alta specificità, buona purezza, richiede molto tempo.
Svantaggi: reagenti e dispositivi più costosi, dipendenza dai marcatori