Whether in immunology, oncology or regenerative medicine - wherever cells are used, cell separation plays a decisive role. Blood and tissue samples contain a large number of different cell types, which together form a complex biological system. For research purposes, however, it is often necessary to isolate specific cells or cell populations in a targeted manner. This is the only way to precisely analyse their properties, functions and interactions.
However, not every method is equally suitable. The choice of the right technique depends on the issue at hand - and also on the purity, viability and yield required. It is not just a question of know-how, but also of the right tools and reagents that enable standardised and reproducible separation.
Basics of cell separation
Cell separation is the separation of specific cells or cell groups from a heterogeneous mixture, such as occurs in blood (whole blood), bone marrow or tissue. The aim is to obtain the desired cells as unchanged and functional as possible.
There are different approaches to this:
- Physical properties: size, density or electrical charge
- Biological characteristics: Surface markers, receptors or antigens
- Mechanical separation: filtration through special sieves or membranes
The challenge lies in finding a balance between purity, speed and cell protection. While some methods deliver a high level of purity, they can also place a greater strain on the cells. Other methods are particularly gentle, but separate less specifically.
Reinheit einer Zellpopulation
beschreibt in der Zellbiologie den Anteil der gewünschten Zellpopulation im Verhältnis zu anderen, unerwünschten Zelltypen nach einem Isolationsprozess. Die Reinheit gibt somit an, wie „sauber“ die isolierte Zellfraktion in Bezug auf ihre zelluläre Zusammensetzung ist.
- Analytische Genauigkeit: eine hohe Reinheit ist entscheidend, um sicherzustellen, dass Messergebnisse (z. B. Genexpressionsanalysen, Proteomik) tatsächlich auf die Zielzellpopulation zurückzuführen sind.
- Reproduzierbarkeit: unreine Proben können zu variablen oder widersprüchlichen Ergebnissen führen.
- Funktionelle Experimente: kontaminierende Zelltypen können die physiologischen Reaktionen oder Signalwege der Zielzellen beeinflussen.
- Durchflusszytometrie (Flow Cytometry): Häufigste Methode; Zellen werden anhand spezifischer Oberflächenmarker charakterisiert.
- Mikroskopische Auswertung: Morphologische Beurteilung, oft ergänzend.
- Molekulare Analysen: Nachweis zellspezifischer Gene oder Proteine zur Überprüfung der Homogenität.
Viabilität (Lebensfähigkeit) der isolierten Zellen
bezeichnet den Anteil intakter, stoffwechselaktiver und überlebensfähiger Zellen innerhalb einer Zellpopulation nach der Isolation. Die Viabilität gibt an, wie viele der isolierten Zellen noch leben und funktionsfähig sind, im Gegensatz zu Zellen, die durch den Isolationsprozess geschädigt oder abgestorben sind. Somit definiert die Viabilität den Prozentsatz lebender Zellen nach der Isolation und ist ein zentraler Indikator für die Qualität und Eignung der isolierten Zellpopulation für weiterführende Analysen oder Kulturen.
- Mechanischer Stress (z. B. zu starkes Pipettieren oder Zentrifugieren)
- Chemische Einflüsse (z. B. ungeeignete Puffer, Temperaturabweichungen)
- Zu lange oder aggressive Aufarbeitungsprozesse
- Ungünstige Lagerungsbedingungen vor oder nach der Isolation
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Die Viabilität kann mit verschiedenen Methoden gemessen werden, z. B.:
- Trypanblau-Ausschlussverfahren: Tote Zellen nehmen den Farbstoff auf, lebende nicht.
- Fluoreszenzfarbstoffe wie Propidiumiodid (PI), 7-AAD oder Annexin V/PI in Kombination mit Durchflusszytometrie.
- Automatisierte Zellzähler (z. B. Countess, NucleoCounter).
Ausbeute bei der Zellisolation
bezeichnet in der Zellbiologie die Gesamtzahl der erfolgreich gewonnenen Zielzellen nach einem Isolationsverfahren im Verhältnis zur ursprünglich vorhandenen Zellzahl in der Ausgangsprobe. Die Ausbeute gibt also an, wie viele der gewünschten Zellen tatsächlich isoliert werden konnten, bezogen auf das theoretisch mögliche Maximum und ist ein zentraler Effizienzparameter bei der Zellisolation. Sie gibt Auskunft darüber, wie effektiv ein Verfahren in der Lage ist, die gewünschte Zellpopulation verlustarm und zielgerichtet zu gewinnen.
Die Ausbeute in % errechnet sich indem die Anzahl isolierter Zielzellen durch die Anzahl der Zielzellen in der Ausgangsprobe dividiert wird und dann mit 100 multipliziert wird. Wenn in einer Blutprobe schätzungsweise 1×10^6 CD4⁺-T-Zellen enthalten sind und nach der Isolation 8×10^5 CD4⁺-T-Zellen vorliegen, beträgt die Ausbeute 80 %.
- die Ausgangsproben limitiert sind (z. B. Biopsien, seltene Zelltypen),
- große Zellmengen für nachfolgende Analysen benötigt werden,
- oder der Isolationsprozess validiert werden soll (z. B. in klinischen Studien oder Diagnostik).
- Effizienz der Trennmethode (z. B. Dichtegradientenzentrifugation, magnetische Separation, FACS)
- Zellverluste durch Adhäsion, Filtration oder Pipettieren
- Zellaggregation oder Klumpenbildung
- Lagerungszeit und Probenqualität vor der Isolation
Methods of cell separation
Various methods are available for the separation of cells. Each method has its own strengths, limitations and typical areas of application.
Cell sieves or sieve cloths are used to separate cells according to size or shape. This method is particularly practical for the preparation of single cell suspensions from tissue or for the purification of samples prior to subsequent analyses.
Advantage: quick, easy, gentle
Disadvantage: lower specificity compared to marker-based methods
Density gradient centrifugation is a classic technique that is primarily used to isolate peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from whole blood. The blood is layered onto a medium with a defined density (e.g. PBMC Spin or Ficoll) and centrifuged. The cell types accumulate in different layers according to their density so that the desired fraction can be easily extracted.
Advantage: reliable, cost-effective
Nachteil: zeitaufwendig, weniger spezifisch als Marker gestützte Methoden
The pluriBead technology enables the targeted enrichment or removal of specific cell types from complex samples such as blood (whole blood) or tissue. pluriBead is a combination of biological specificity and mechanical separation. Using specific antibodies, the desired cells are bound to small monodisperse beads and then selectively separated using filter processes - completely without a magnetic field. The process is fast, gentle and flexible: it is suitable for different cell types, can be easily scaled and preserves the functionality of the cells. Ideal for immune cell analyses, preparations for single cell studies or other applications where high purity cell populations are required.
Advantage: high specificity, good purity, fast
Disadvantage: more expensive reagents, marker dependence
Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) uses magnetic particles that bind specifically to cell surface markers. The labelled cells can then be specifically enriched or removed with the aid of a magnetic field. This technique is particularly useful when high-purity cell populations are required, e.g. for immune cell studies. This method is suitable for both positive and negative cell separation.
Advantage: high specificity, good purity
Disadvantage: more expensive reagents, marker dependence
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) is a method in which cells can be individually analysed and sorted based on their surface markers and fluorescence signals. This technique not only allows separation, but also provides comprehensive data on each individual cell.
Advantage: high specificity, good purity, time-consuming
Disadvantage: more expensive reagents and devices, marker dependency