免疫学であれ、腫瘍学であれ、再生医療であれ、細胞が使用されるあらゆる場所で、細胞分離は決定的な役割を果たしている。血液や組織のサンプルには、多数の異なるタイプの細胞が含まれており、それらが一緒になって複雑な生物学的システムを形成している。しかし研究目的のためには、しばしば特定の細胞や細胞集団を分離する必要がある。 。これが、それらの特性、機能、相互作用を正確に分析する唯一の方法である。
しかし、どの方法も同じように適しているわけではない。適切な手法の選択は、目の前にある問題、そして必要とされる純度、生存率、収率によって決まる。それは単にノウハウの問題ではなく、標準化された再現性のある分離を可能にする適切なツールと試薬の問題でもある。
細胞分離の基礎
細胞分離とは、血液（全血）、骨髄、組織などに存在するような不均質な混合物から、特定の細胞や細胞群を分離することである。その目的は、可能な限り変化せず機能的な、目的の細胞を得ることである。
これにはさまざまなアプローチがある：
- 物理的特性：サイズ、密度、電荷
- 生物学的特徴：表面マーカー、受容体、抗原
- 機械的分離：特殊なふるいや膜を通したろ過
課題は、純度、スピード、細胞保護のバランスを見つけることにある。純度の高い方法もあるが、細胞への負担が大きい。他の方法は特に穏やかだが、分離はあまり特異的ではない。
Reinheit einer Zellpopulation
beschreibt in der Zellbiologie den Anteil der gewünschten Zellpopulation im Verhältnis zu anderen, unerwünschten Zelltypen nach einem Isolationsprozess. Die Reinheit gibt somit an, wie „sauber“ die isolierte Zellfraktion in Bezug auf ihre zelluläre Zusammensetzung ist.
- Analytische Genauigkeit: eine hohe Reinheit ist entscheidend, um sicherzustellen, dass Messergebnisse (z. B. Genexpressionsanalysen, Proteomik) tatsächlich auf die Zielzellpopulation zurückzuführen sind.
- Reproduzierbarkeit: unreine Proben können zu variablen oder widersprüchlichen Ergebnissen führen.
- Funktionelle Experimente: kontaminierende Zelltypen können die physiologischen Reaktionen oder Signalwege der Zielzellen beeinflussen.
- Durchflusszytometrie (Flow Cytometry): Häufigste Methode; Zellen werden anhand spezifischer Oberflächenmarker charakterisiert.
- Mikroskopische Auswertung: Morphologische Beurteilung, oft ergänzend.
- Molekulare Analysen: Nachweis zellspezifischer Gene oder Proteine zur Überprüfung der Homogenität.
Viabilität (Lebensfähigkeit) der isolierten Zellen
bezeichnet den Anteil intakter, stoffwechselaktiver und überlebensfähiger Zellen innerhalb einer Zellpopulation nach der Isolation. Die Viabilität gibt an, wie viele der isolierten Zellen noch leben und funktionsfähig sind, im Gegensatz zu Zellen, die durch den Isolationsprozess geschädigt oder abgestorben sind. Somit definiert die Viabilität den Prozentsatz lebender Zellen nach der Isolation und ist ein zentraler Indikator für die Qualität und Eignung der isolierten Zellpopulation für weiterführende Analysen oder Kulturen.
- Mechanischer Stress (z. B. zu starkes Pipettieren oder Zentrifugieren)
- Chemische Einflüsse (z. B. ungeeignete Puffer, Temperaturabweichungen)
- Zu lange oder aggressive Aufarbeitungsprozesse
- Ungünstige Lagerungsbedingungen vor oder nach der Isolation
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Die Viabilität kann mit verschiedenen Methoden gemessen werden, z. B.:
- Trypanblau-Ausschlussverfahren: Tote Zellen nehmen den Farbstoff auf, lebende nicht.
- Fluoreszenzfarbstoffe wie Propidiumiodid (PI), 7-AAD oder Annexin V/PI in Kombination mit Durchflusszytometrie.
- Automatisierte Zellzähler (z. B. Countess, NucleoCounter).
Ausbeute bei der Zellisolation
bezeichnet in der Zellbiologie die Gesamtzahl der erfolgreich gewonnenen Zielzellen nach einem Isolationsverfahren im Verhältnis zur ursprünglich vorhandenen Zellzahl in der Ausgangsprobe. Die Ausbeute gibt also an, wie viele der gewünschten Zellen tatsächlich isoliert werden konnten, bezogen auf das theoretisch mögliche Maximum und ist ein zentraler Effizienzparameter bei der Zellisolation. Sie gibt Auskunft darüber, wie effektiv ein Verfahren in der Lage ist, die gewünschte Zellpopulation verlustarm und zielgerichtet zu gewinnen.
Die Ausbeute in % errechnet sich indem die Anzahl isolierter Zielzellen durch die Anzahl der Zielzellen in der Ausgangsprobe dividiert wird und dann mit 100 multipliziert wird. Wenn in einer Blutprobe schätzungsweise 1×10^6 CD4⁺-T-Zellen enthalten sind und nach der Isolation 8×10^5 CD4⁺-T-Zellen vorliegen, beträgt die Ausbeute 80 %.
- die Ausgangsproben limitiert sind (z. B. Biopsien, seltene Zelltypen),
- große Zellmengen für nachfolgende Analysen benötigt werden,
- oder der Isolationsprozess validiert werden soll (z. B. in klinischen Studien oder Diagnostik).
- Effizienz der Trennmethode (z. B. Dichtegradientenzentrifugation, magnetische Separation, FACS)
- Zellverluste durch Adhäsion, Filtration oder Pipettieren
- Zellaggregation oder Klumpenbildung
- Lagerungszeit und Probenqualität vor der Isolation
細胞分離の方法
細胞の分離には様々な方法がある。それぞれの方法には長所、限界、典型的な応用分野がある。
細胞ふるいまたはふるい布は、細胞を大きさや形に応じて分離するために使用される。この方法は、組織からの単一細胞懸濁液の調製や、その後の分析前のサンプルの精製に特に実用的である。
利点：迅速、簡単、優しい
欠点：マーカーに基づく方法に比べて特異性が低い。
密度勾配遠心法は、主に全血から末梢血単核球（PBMC）を分離するために用いられる古典的な技術である。血液を決められた密度の培地（PBMC SpinやFicollなど）に層別し、遠心分離する。細胞種は密度に応じて異なる層に集積するため、目的の分画を容易に抽出することができる。
利点：信頼性、費用対効果
Nachteil: zeitaufwendig, weniger spezifisch als Marker gestützte Methoden
pluriBeadテクノロジーは、血液（全血）や組織のような複雑なサンプルから、特定の細胞タイプの標的濃縮や除去を可能にする。pluriBeadは、生物学的特異性と機械的分離の組み合わせである。特異的抗体を用いて、目的の細胞を小さな単分散ビーズに結合させ、フィルタープロセスを用いて選択的に分離する。このプロセスは迅速で、優しく、フレキシブルです。様々な細胞タイプに適しており、簡単にスケールアップでき、細胞の機能性を保持します。免疫細胞分析、単一細胞研究のための調製、または高純度の細胞集団が必要とされるその他のアプリケーションに最適です。
利点：高い特異性、良好な純度、迅速性
欠点：高価な試薬、マーカー依存性
磁気活性化セルソーティング（MACS）は、細胞表面マーカーに特異的に結合する磁性粒子を用いる。標識された細胞は、磁場の助けを借りて、特異的に濃縮または除去される。この技術は、免疫細胞研究など、高純度の細胞集団が必要な場合に特に有用である。この方法は陽性、陰性どちらの細胞分離にも適している。
利点：高い特異性、良好な純度
欠点：高価な試薬、マーカー依存性
蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、細胞の表面マーカーと蛍光シグナルに基づいて細胞を個別に分析し、選別する方法である。この技術は分離を可能にするだけでなく、個々の細胞に関する包括的なデータを提供する。
利点：特異性が高い、純度が高い、時間がかかる
欠点：高価な試薬と装置、マーカー依存性