Berigelse af celler og optimering af celleseparationsmetoder spiller en afgørende rolle for mange forskere. Der er forskellige tilgange til sortering af forskellige celletyper, og valget af den rette metode afhænger ofte af celletypen eller celleundergruppen. En af de hurtigere og mere omkostningseffektive metoder til at adskille celler er tæthedsgradientcentrifugering. Baseret på de forskellige tætheder af de enkelte blodkomponenter kan disse adskilles ved centrifugering i et enkelt trin med det passende tæthedsgradientmedium. Teknikken er baseret på det faktum, at partikler med forskellige densiteter har forskellige sedimentationshastigheder under centrifugering. Tunge partikler som f.eks. erytrocytter sedimenterer hurtigt, mens lettere celler som f.eks. trombocytter sedimenterer langsommere. Den følgende figur viser fordelingen af de vigtigste cellepopulationer i blodet. Erythrocytterne har den højeste tæthed og trombocytterne den laveste.
Verteilung von Blutzellen in Abhängigkeit von der Dichte
Die folgende Abbildung zeigt die Verteilung von Blutzellen in Abhängigkeit von deren Dichte. Thrombozyten (1) haben die geringste Dichte, Erythrozyten (2) die höchste Dichte. Zudem ist die Anzahl der Zellen pro Population dargestellt. Erythrozyten stellen die größte Population, Thrombozyten die zweitgrößte Population dar.
Figur: Blod består hovedsageligt af følgende cellepopulationer: Trombocytter (1), monocytter (2), lymfocytter (3), basofile granulocytter (4), neutrofile granulocytter (5), eosinofile granulocytter (6) og erythrocytter (7). Cellepopulationerne adskiller sig i deres tæthed og celleantal. De forskellige tætheder af cellepopulationerne kan bruges til berigelse med tæthedsmedier.
Tabelle: Dichtebereiche von Blutzellen
Type | Blodcelle | Tæthed (g/ml) |
1 | Trombocytter | 1,050 - 1,070 |
2 | Monocytter | 1,060 - 1,068 |
3 | Lymfocytter | 1,067 - 1,077 |
4 | Basofile granulocytter | 1,072 - 1,081 |
5 | Neutrofil granulocyt | 1,079 - 1,098 |
6 | Eosinofile granulocytter | 1,089 - 1,095 |
7 | Erytrocytter | 1.090 - > 1.100 |
Wie man aus der Abbildung und der Tabelle sehen kann, ist die Dichte der Zellen bzw. Zellpopulationen eine Verteilung um einen Mittelwert. Zudem überschneiden sich die Dichten der unterschiedlichen Zellpopulationen. Der Bereich als auch die Verteilung um den Mittelwert sind keinen festen Größen. Schwankungen in der Dichte kann durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden. Ein wichtigster Einflussfaktoren auf die Dichte der Zellen ist die Hydratisierung der Zellen. Ein weiterer wichtiger Einflussfaktor auf die Dichte der Vollblutzellen, ist die Zeit außerhalb des Spenderorganismus.
Verwendung von Dichte-Gradienten-Medien für die Dichte-Gradienten-Zentrifugation
Mit dem Wissen um die Dichte von Blutzellen ist es möglich, verschiedene Zellpopulationen gezielt anzureichern. Dabei kommen Dichte-Gradienten-Medien zum Einsatz – Lösungen mit einer definierten Dichte. Diese Dichte bestimmt die Trenngrenze (Cut-off). Zellen mit einer geringeren Dichte als der Cut-off sammeln sich als Schicht oberhalb des Mediums, während Zellen mit einer höheren Dichte das Trennmedium passieren und sich am Boden des Röhrchens absetzen. Die folgende Abbildung zeigt ein typisches Bild für die Trennung von Vollblut mit einem Trennmedium zur Anreicherung von periphere mononukleäre Blutzellen - kurz PBMC.
Abbildung 2: Verteilung der Schichten nach einer Dichte-Gradienten-Zentrifugation von Vollblut mit PBMC Spin Medium. PBMC (2) sammeln sich zwischen Plasma (1) und Dichtemedium (3). Erythrozyten, Granulozyten und tote Zellen passieren das Medium und werden am Boden des Röhrchens (4) konzentriert.