L'arricchimento delle cellule e l'ottimizzazione dei metodi di separazione cellulare svolgono un ruolo cruciale per molti ricercatori. Esistono diversi approcci per selezionare i vari tipi di cellule e la scelta del metodo appropriato dipende spesso dal tipo o dal sottoinsieme di cellule. Uno dei metodi più rapidi ed economici per separare le cellule è la centrifugazione a gradiente di densità. In base alle diverse densità dei singoli componenti del sangue, questi possono essere separati mediante centrifugazione in un unico stadio con il mezzo gradiente di densità appropriato. La tecnica si basa sul fatto che le particelle con densità diverse hanno velocità di sedimentazione diverse durante la centrifugazione. Le particelle pesanti, come gli eritrociti, sedimentano rapidamente, mentre le cellule più leggere, come i trombociti, sedimentano più lentamente. La figura seguente mostra la distribuzione delle popolazioni cellulari più importanti nel sangue. Gli eritrociti hanno la densità più alta e i trombociti la densità più bassa.
Verteilung von Blutzellen in Abhängigkeit von der Dichte
Die folgende Abbildung zeigt die Verteilung von Blutzellen in Abhängigkeit von deren Dichte. Thrombozyten (1) haben die geringste Dichte, Erythrozyten (2) die höchste Dichte. Zudem ist die Anzahl der Zellen pro Population dargestellt. Erythrozyten stellen die größte Population, Thrombozyten die zweitgrößte Population dar.
Figura: Il sangue è composto principalmente dalle seguenti popolazioni cellulari: Trombociti (1), monociti (2), linfociti (3), granulociti basofili (4), granulociti neutrofili (5), granulociti eosinofili (6) ed eritrociti (7). Le popolazioni cellulari differiscono per densità e numero di cellule. Le diverse densità delle popolazioni cellulari possono essere utilizzate per l'arricchimento con mezzi di densità.
Tabelle: Dichtebereiche von Blutzellen
tipo | Cellule del sangue | Densità (g/ml) |
1 | Trombociti | 1,050 - 1,070 |
2 | Monociti | 1,060 - 1,068 |
3 | Linfociti | 1,067 - 1,077 |
4 | Granulociti basofili | 1,072 - 1,081 |
5 | Neutrofili granulociti | 1,079 - 1,098 |
6 | Granulociti eosinofili | 1,089 - 1,095 |
7 | Eritrociti | 1.090 - > 1.100 |
Wie man aus der Abbildung und der Tabelle sehen kann, ist die Dichte der Zellen bzw. Zellpopulationen eine Verteilung um einen Mittelwert. Zudem überschneiden sich die Dichten der unterschiedlichen Zellpopulationen. Der Bereich als auch die Verteilung um den Mittelwert sind keinen festen Größen. Schwankungen in der Dichte kann durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden. Ein wichtigster Einflussfaktoren auf die Dichte der Zellen ist die Hydratisierung der Zellen. Ein weiterer wichtiger Einflussfaktor auf die Dichte der Vollblutzellen, ist die Zeit außerhalb des Spenderorganismus.
Verwendung von Dichte-Gradienten-Medien für die Dichte-Gradienten-Zentrifugation
Mit dem Wissen um die Dichte von Blutzellen ist es möglich, verschiedene Zellpopulationen gezielt anzureichern. Dabei kommen Dichte-Gradienten-Medien zum Einsatz – Lösungen mit einer definierten Dichte. Diese Dichte bestimmt die Trenngrenze (Cut-off). Zellen mit einer geringeren Dichte als der Cut-off sammeln sich als Schicht oberhalb des Mediums, während Zellen mit einer höheren Dichte das Trennmedium passieren und sich am Boden des Röhrchens absetzen. Die folgende Abbildung zeigt ein typisches Bild für die Trennung von Vollblut mit einem Trennmedium zur Anreicherung von periphere mononukleäre Blutzellen - kurz PBMC.
Abbildung 2: Verteilung der Schichten nach einer Dichte-Gradienten-Zentrifugation von Vollblut mit PBMC Spin Medium. PBMC (2) sammeln sich zwischen Plasma (1) und Dichtemedium (3). Erythrozyten, Granulozyten und tote Zellen passieren das Medium und werden am Boden des Röhrchens (4) konzentriert.