El enriquecimiento celular y la optimización de los métodos de separación celular desempeñan un papel crucial para muchos investigadores. Existen diversos enfoques para clasificar diferentes tipos celulares, y la elección del método apropiado a menudo depende del tipo o subconjunto celular. Uno de los métodos más rápidos y rentables para separar células es la centrifugación en gradiente de densidad. Basándose en las diferentes densidades de los componentes sanguíneos individuales, estos pueden separarse mediante centrifugación de un solo paso con el medio de gradiente de densidad adecuado. La técnica se basa en el hecho de que durante la centrifugación, las partículas con diferentes densidades tienen diferentes velocidades de sedimentación. Las partículas pesadas, como los eritrocitos, sedimentan rápidamente, mientras que las células más ligeras, como los trombocitos, sedimentan más lentamente. La siguiente figura muestra la distribución de las poblaciones celulares más importantes en la sangre. Los eritrocitos tienen la densidad más alta y las plaquetas la más baja.
Verteilung von Blutzellen in Abhängigkeit von der Dichte
Die folgende Abbildung zeigt die Verteilung von Blutzellen in Abhängigkeit von deren Dichte. Thrombozyten (1) haben die geringste Dichte, Erythrozyten (2) die höchste Dichte. Zudem ist die Anzahl der Zellen pro Population dargestellt. Erythrozyten stellen die größte Population, Thrombozyten die zweitgrößte Population dar.
Figura: La sangre se compone principalmente de las siguientes poblaciones celulares: trombocitos (1), monocitos (2), linfocitos (3), granulocitos basófilos (4), granulocitos neutrófilos (5), granulocitos eosinófilos (6) y eritrocitos (7). Las poblaciones celulares difieren en densidad y número de células. Las diferentes densidades de las poblaciones celulares pueden utilizarse para el enriquecimiento mediante medios de densidad.
Tabelle: Dichtebereiche von Blutzellen
Tipo | Glóbulo sanguíneo | Densidad (g/ml) |
1 | trombocitos | 1.050 - 1.070 |
2 | Monocitos | 1.060 - 1.068 |
3 | Linfocitos | 1.067 - 1.077 |
4 | granulocitos basófilos | 1.072 - 1.081 |
5 | Granulocito neutrófilo | 1.079 - 1.098 |
6 | granulocitos eosinófilos | 1.089 - 1.095 |
7 | eritrocitos | 1.090 - > 1.100 |
Wie man aus der Abbildung und der Tabelle sehen kann, ist die Dichte der Zellen bzw. Zellpopulationen eine Verteilung um einen Mittelwert. Zudem überschneiden sich die Dichten der unterschiedlichen Zellpopulationen. Der Bereich als auch die Verteilung um den Mittelwert sind keinen festen Größen. Schwankungen in der Dichte kann durch verschiedene Faktoren beeinflusst werden. Ein wichtigster Einflussfaktoren auf die Dichte der Zellen ist die Hydratisierung der Zellen. Ein weiterer wichtiger Einflussfaktor auf die Dichte der Vollblutzellen, ist die Zeit außerhalb des Spenderorganismus.
Verwendung von Dichte-Gradienten-Medien für die Dichte-Gradienten-Zentrifugation
Mit dem Wissen um die Dichte von Blutzellen ist es möglich, verschiedene Zellpopulationen gezielt anzureichern. Dabei kommen Dichte-Gradienten-Medien zum Einsatz – Lösungen mit einer definierten Dichte. Diese Dichte bestimmt die Trenngrenze (Cut-off). Zellen mit einer geringeren Dichte als der Cut-off sammeln sich als Schicht oberhalb des Mediums, während Zellen mit einer höheren Dichte das Trennmedium passieren und sich am Boden des Röhrchens absetzen. Die folgende Abbildung zeigt ein typisches Bild für die Trennung von Vollblut mit einem Trennmedium zur Anreicherung von periphere mononukleäre Blutzellen - kurz PBMC.
Abbildung 2: Verteilung der Schichten nach einer Dichte-Gradienten-Zentrifugation von Vollblut mit PBMC Spin Medium. PBMC (2) sammeln sich zwischen Plasma (1) und Dichtemedium (3). Erythrozyten, Granulozyten und tote Zellen passieren das Medium und werden am Boden des Röhrchens (4) konzentriert.