PBMC - Cellule mononucleari del sangue periferico
Una cellula mononucleare del sangue periferico (PBMC) è una cellula del sangue con un singolo nucleo rotondo. Il termine "periferico" si riferisce alle cellule ematiche mature che non si trovano negli organi ematopoietici come il midollo osseo, ma circolano nel sangue periferico.
NOTA: Il sangue periferico è il sangue che entra nei vasi sanguigni dopo la sua formazione nel midollo osseo e vi circola. Il nostro articolo:"Il sangue intero come materiale di partenza per la separazione delle cellule". contiene altre interessanti informazioni sul tema del sangue.
Oltre al plasma sanguigno, che funge da mezzo di trasporto, tra i componenti principali del sangue periferico figurano anche i globuli rossi Cellule del sangue (eritrociti), Globuli bianchi (leucociti) ) e le piastrine del sangue (trombociti).
I PBMC, talvolta chiamati PMNC (cellule mononucleari periferiche) o MNC (cellule mononucleari), comprendono tutti i leucociti mononucleati. Questi includono:
- Linfociti (linfociti T, linfociti B, linfociti NK)
- Monociti
- Cellule dendritiche e
- Granulociti basofili.
Isolamento/arricchimento di PBMC mediante centrifugazione a gradiente di densità
Il termine PBMC (cellule mononucleari del sangue periferico) è strettamente associato all'isolamento di cellule da purosangue attraverso un Centrifugazione a gradiente di densitàÈ possibile separare i componenti del sangue in quanto hanno densità diverse; ciò avviene mediante centrifugazione in un'unica fase in un adeguato mezzo a gradiente di densità. Il cut-off per le cellule mononucleate è 1,077 g/ml.
Le PBMC arricchite con gradiente di densità sono talvolta denominate “buffy coat”. In questo contesto, il termine “buffy coat” descrive lo strato di leucociti arricchiti nella fase interfasica. In questo caso specifico, il buffy coat è costituito esclusivamente da cellule mononucleari ed è quindi un buffy coat speciale.
I leucociti polimorfonucleati (con nuclei multipli segmentati), come i granulociti, sono impoveriti in questa frazione. I granulociti neutrofili ed eosinofili non possono essere arricchiti da una frazione di PBMC preparata mediante separazione a gradiente di densità standard (il mezzo ha una densità di 1,077 g/ml). I granulociti basofili hanno una densità diversa e possono essere parzialmente trovati nella frazione PBMC. Gli eritrociti sono molto ridotti rispetto alla conta cellulare originale.
In primo luogo, una soluzione di polimero sintetico con una densità specifica viene sovrapposta al sangue o al materiale campione. Dopo la preparazione, avviene una fase di centrifugazione. Le cellule con la densità corrispondente si accumulano nell'interfase tra le due soluzioni. L'interfase contenente le PBMC viene accuratamente rimossa. Le cellule mononucleari arricchite vengono poi lavate e utilizzate per ulteriori applicazioni.
Processo generale di arricchimento delle PBMC utilizzando un terreno a gradiente di densità
In primo luogo, una soluzione di polimero sintetico con una densità definita viene sovrapposta al sangue o al materiale campione. Dopo la preparazione, viene eseguita una fase di centrifugazione. Le cellule si accumulano nell'interfase tra le due soluzioni alla densità corrispondente. L'interfase contenente le PBMC viene accuratamente rimossa. Le cellule mononucleate arricchite vengono quindi lavate e utilizzate per ulteriori applicazioni.
Isolamento/arricchimento di PBMC con il terreno di rotazione PBMC
Il purosangue sarà attentamente terreno di rotazione PBMC (2), che viene posto in una provetta da centrifuga. Si assicuri che i due liquidi non si mescolino. In alternativa, si possono usare le provette pluriMate. La barriera pluriMate facilita la stratificazione e impedisce al materiale del campione di mescolarsi con il mezzo di densità.
Fig. 1: Preparazione dei PBMC con terreno di rotazione PBMC. Il materiale campione (1) viene posizionato con cura sul supporto di densità (2).
Nella successiva fase di centrifugazione, l'effettiva centrifugazione a gradiente di densitàil campione viene suddiviso in diversi strati. Le cellule mononucleate (2) sono arricchite tra il plasma (1) e il mezzo di densità (3).
