Que ce soit en immunologie, en oncologie ou en médecine régénérative, partout où l'on travaille avec des cellules, la séparation cellulaire joue un rôle décisif. Les échantillons de sang et de tissus contiennent une multitude de types de cellules différents qui forment ensemble un système biologique complexe. Or, pour la recherche, il est souvent nécessaire d'isoler de manière ciblée certaines cellules ou populations de cellules . C'est la seule façon d'étudier avec précision leurs propriétés, leurs fonctions et leurs interactions.
Mais toutes les méthodes ne se valent pas. Le choix de la bonne technique dépend de la question posée - et aussi de la pureté, de la viabilité et du rendement requis. Ce qui compte ici, ce n'est pas seulement le savoir-faire, mais aussi les outils et les réactifs adéquats qui permettent une séparation standardisée et reproductible.
Principes de base de la séparation des cellules
Par séparation cellulaire, on entend la séparation de certaines cellules ou groupes de cellules à partir d'un mélange hétérogène, tel qu'on le trouve par exemple dans le sang (sang total), la moelle osseuse ou les tissus. L'objectif est de récupérer les cellules souhaitées, si possible inchangées et fonctionnelles.
Il existe différentes approches pour cela :
- Propriétés physiques: taille, densité ou charge électrique
- caractéristiques biologiques: marqueurs de surface, récepteurs ou antigènes
- Séparation mécanique: filtration à travers des tamis spéciaux ou des membranes
Le défi consiste à trouver un équilibre entre la pureté, la vitesse et la protection des cellules. Alors que certaines méthodes fournissent une grande pureté, elles peuvent en même temps être plus agressives pour les cellules. D'autres méthodes sont particulièrement douces, mais séparent de manière moins spécifique.
Reinheit einer Zellpopulation
beschreibt in der Zellbiologie den Anteil der gewünschten Zellpopulation im Verhältnis zu anderen, unerwünschten Zelltypen nach einem Isolationsprozess. Die Reinheit gibt somit an, wie „sauber“ die isolierte Zellfraktion in Bezug auf ihre zelluläre Zusammensetzung ist.
- Analytische Genauigkeit: eine hohe Reinheit ist entscheidend, um sicherzustellen, dass Messergebnisse (z. B. Genexpressionsanalysen, Proteomik) tatsächlich auf die Zielzellpopulation zurückzuführen sind.
- Reproduzierbarkeit: unreine Proben können zu variablen oder widersprüchlichen Ergebnissen führen.
- Funktionelle Experimente: kontaminierende Zelltypen können die physiologischen Reaktionen oder Signalwege der Zielzellen beeinflussen.
- Durchflusszytometrie (Flow Cytometry): Häufigste Methode; Zellen werden anhand spezifischer Oberflächenmarker charakterisiert.
- Mikroskopische Auswertung: Morphologische Beurteilung, oft ergänzend.
- Molekulare Analysen: Nachweis zellspezifischer Gene oder Proteine zur Überprüfung der Homogenität.
Viabilität (Lebensfähigkeit) der isolierten Zellen
bezeichnet den Anteil intakter, stoffwechselaktiver und überlebensfähiger Zellen innerhalb einer Zellpopulation nach der Isolation. Die Viabilität gibt an, wie viele der isolierten Zellen noch leben und funktionsfähig sind, im Gegensatz zu Zellen, die durch den Isolationsprozess geschädigt oder abgestorben sind. Somit definiert die Viabilität den Prozentsatz lebender Zellen nach der Isolation und ist ein zentraler Indikator für die Qualität und Eignung der isolierten Zellpopulation für weiterführende Analysen oder Kulturen.
- Mechanischer Stress (z. B. zu starkes Pipettieren oder Zentrifugieren)
- Chemische Einflüsse (z. B. ungeeignete Puffer, Temperaturabweichungen)
- Zu lange oder aggressive Aufarbeitungsprozesse
- Ungünstige Lagerungsbedingungen vor oder nach der Isolation
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Die Viabilität kann mit verschiedenen Methoden gemessen werden, z. B.:
- Trypanblau-Ausschlussverfahren: Tote Zellen nehmen den Farbstoff auf, lebende nicht.
- Fluoreszenzfarbstoffe wie Propidiumiodid (PI), 7-AAD oder Annexin V/PI in Kombination mit Durchflusszytometrie.
- Automatisierte Zellzähler (z. B. Countess, NucleoCounter).
Ausbeute bei der Zellisolation
bezeichnet in der Zellbiologie die Gesamtzahl der erfolgreich gewonnenen Zielzellen nach einem Isolationsverfahren im Verhältnis zur ursprünglich vorhandenen Zellzahl in der Ausgangsprobe. Die Ausbeute gibt also an, wie viele der gewünschten Zellen tatsächlich isoliert werden konnten, bezogen auf das theoretisch mögliche Maximum und ist ein zentraler Effizienzparameter bei der Zellisolation. Sie gibt Auskunft darüber, wie effektiv ein Verfahren in der Lage ist, die gewünschte Zellpopulation verlustarm und zielgerichtet zu gewinnen.
Die Ausbeute in % errechnet sich indem die Anzahl isolierter Zielzellen durch die Anzahl der Zielzellen in der Ausgangsprobe dividiert wird und dann mit 100 multipliziert wird. Wenn in einer Blutprobe schätzungsweise 1×10^6 CD4⁺-T-Zellen enthalten sind und nach der Isolation 8×10^5 CD4⁺-T-Zellen vorliegen, beträgt die Ausbeute 80 %.
- die Ausgangsproben limitiert sind (z. B. Biopsien, seltene Zelltypen),
- große Zellmengen für nachfolgende Analysen benötigt werden,
- oder der Isolationsprozess validiert werden soll (z. B. in klinischen Studien oder Diagnostik).
- Effizienz der Trennmethode (z. B. Dichtegradientenzentrifugation, magnetische Separation, FACS)
- Zellverluste durch Adhäsion, Filtration oder Pipettieren
- Zellaggregation oder Klumpenbildung
- Lagerungszeit und Probenqualität vor der Isolation
Méthodes de séparation des cellules
Il existe différentes méthodes pour la séparation des cellules. Chaque méthode a ses propres points forts, ses propres limites et ses domaines d'application typiques.
Dans ce cas, des tamis cellulaires ou des tissus de tamisage sont utilisés pour séparer les cellules selon leur taille ou leur forme. Cette méthode est particulièrement pratique pour la préparation de suspensions de cellules individuelles à partir de tissus ou pour la purification d'échantillons avant des analyses ultérieures.
Avantage : rapide, simple, doux
Inconvénient : spécificité moindre par rapport aux méthodes basées sur les marqueurs
La centrifugation à gradient de densité est une technique classique utilisée principalement pour isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) du sang total. Pour ce faire, le sang est déposé en couches sur un milieu de densité définie (par ex. PBMC Spin ou Ficoll) et centrifugé. Les types de cellules s'accumulent dans différentes couches en fonction de leur densité, ce qui permet de prélever facilement la fraction souhaitée.
Avantage : fiable, économique
Nachteil: zeitaufwendig, weniger spezifisch als Marker gestützte Methoden
La technologie pluriBead permet l'enrichissement ou l'élimination ciblée de certains types de cellules dans des échantillons complexes comme le sang (sang total) ou les tissus. pluriBead est une combinaison de spécificité biologique et de séparation mécanique. À l'aide d'anticorps spécifiques, les cellules souhaitées sont liées à de petites billes monodisperses et ensuite séparées de manière sélective par des processus de filtrage - sans aucun champ magnétique. Le procédé est rapide, doux et flexible : il convient à différents types de cellules, est facilement modulable et préserve la fonctionnalité des cellules. Il est idéal pour les analyses de cellules immunitaires, la préparation d'études sur des cellules uniques ou d'autres applications nécessitant des populations de cellules très pures.
Avantage : haute spécificité, bonne pureté, rapide
Inconvénient : réactifs plus chers, dépendance du marqueur
Le Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) utilise des particules magnétiques qui se lient spécifiquement aux marqueurs de surface des cellules. Les cellules marquées peuvent ensuite être enrichies ou éliminées de manière ciblée à l'aide d'un champ magnétique. Cette technique est particulièrement utile lorsque des populations de cellules très pures sont nécessaires, par exemple pour les études sur les cellules immunitaires. Cette méthode convient aussi bien pour la séparation positive que négative des cellules.
Avantage : haute spécificité, bonne pureté
Inconvénient : réactifs plus chers, dépendance du marqueur
Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est une méthode qui permet d'analyser et de trier les cellules individuellement à l'aide de leurs marqueurs de surface et de leurs signaux de fluorescence. Cette technique permet non seulement la séparation, mais fournit en même temps de nombreuses données sur chaque cellule.
Avantage : haute spécificité, bonne pureté, prend du temps
Inconvénient : réactifs et appareils plus chers, dépendance du marqueur