PBMC - Cellule Mononucleate del Sangue Periferico
Una cellula mononucleare del sangue periferico (PBMC) è una cellula del sangue con un singolo nucleo rotondo. Il termine "periferico" si riferisce alle cellule ematiche mature che non si trovano negli organi ematopoietici come il midollo osseo, ma circolano nel sangue periferico.
NOTA: Il sangue periferico è il sangue che entra nei vasi sanguigni dopo la sua formazione nel midollo osseo e vi circola. Il nostro articolo:"Il sangue intero come materiale di partenza per la separazione delle cellule". contiene altre interessanti informazioni sul tema del sangue.
I componenti principali del sangue periferico sono il plasma sanguigno, che funge da mezzo di trasporto, i globuli rossi e il sangue di origine animale. Cellule del sangue (eritrociti), Globuli bianchi (leucociti) e le piastrine del sangue (trombociti).
Le PBMC, talvolta indicate come PMNC (cellule mononucleari periferiche) o MNC (cellule mononucleari), comprendono tutti i leucociti mononucleati. Queste includono:
- Linfociti (linfociti T, linfociti B, linfociti NK)
- Monociti
- cellule dendritiche e
- granulociti basofili.
Arricchimento di PBMC mediante centrifugazione a gradiente di densità
Il termine PBMC (cellule mononucleari del sangue periferico) è strettamente legato all'accumulo di cellule provenienti da purosangue per mezzo di un centrifugazione a gradiente di densità La separazione dei componenti del sangue è possibile in quanto hanno densità diverse; ciò avviene mediante centrifugazione in un'unica fase in un adeguato mezzo a gradiente di densità. Il cut-off per le cellule mononucleari è 1,077 g/ml.
Le PBMC arricchite dal gradiente di densità sono talvolta indicate come buffy coat. In questo contesto, il buffy coat descrive lo strato di leucociti arricchiti nell'interfase. In questo caso particolare, le PBMC, il buffy coat è costituito solo da cellule mononucleate ed è in questo senso un buffy coat speciale.
I leucociti polimorfonucleati (con nuclei multipli segmentati), come i granulociti, sono impoveriti nei PBMC. I granulociti neutrofili ed eosinofili non possono quindi essere arricchiti da una frazione di PBMC preparata mediante separazione standard in gradiente di densità (il mezzo ha una densità di 1,077 g/ml). I granulociti basofili differiscono per densità e possono essere parzialmente trovati nella frazione di PBMC. Gli eritrociti sono fortemente ridotti rispetto alla conta cellulare iniziale.
Processo generale di arricchimento delle PBMC utilizzando un terreno a gradiente di densità
In primo luogo, una soluzione di polimero sintetico con una densità definita viene sovrapposta al sangue o al materiale campione. Dopo la preparazione, viene eseguita una fase di centrifugazione. Le cellule si accumulano nell'interfase tra le due soluzioni alla densità corrispondente. L'interfase contenente le PBMC viene accuratamente rimossa. Le cellule mononucleate arricchite vengono quindi lavate e utilizzate per ulteriori applicazioni.
Isolamento o arricchimento di PBMC con PBMC Spin Medium
Da purosangue (1) viene prima accuratamente applicata alla terreno di rotazione PBMC (2), che viene posto in una provetta da centrifuga. Occorre fare attenzione che i due liquidi non si mescolino. In alternativa, si possono usare le provette pluriMate. La barriera pluriMate facilita la stratificazione e impedisce al materiale del campione di mescolarsi con il mezzo a gradiente di densità.
Fig. 1: Preparazione di PBMC con terreno di rotazione PBMC. Il materiale del campione (1) viene accuratamente posizionato sul supporto di densità (2).
Nella successiva fase di centrifugazione, l'effettiva centrifugazione a gradiente di densità il campione viene separato nei diversi strati. Le cellule mononucleate (2) sono arricchite tra il plasma (1) e il mezzo di densità (3).
